線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量試劑盒說明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號(hào)：QYS-233023
分光光度法 50管/48樣
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
線粒體檸檬酸(MCA)測(cè)定意義：
CA 是線粒體三羧酸循環(huán)的第一個(gè)中間產(chǎn)物，由檸檬酸合酶催化乙酰 CoA 與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環(huán)強(qiáng)度的主要指標(biāo)之一。配合測(cè)定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 CA 含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進(jìn)行程度，（2）綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰 CoA 含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰 CoA 情況，（3）乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 CA 含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進(jìn)行狀況。
線粒體檸檬酸(MCA)測(cè)定原理：
CA 在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進(jìn)一步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在 330nm 處有吸收峰，該波長(zhǎng)下吸光度的變化程度可反映出 CA 的含量。
自備儀器和用品：
分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL 石英比色皿、研缽和蒸餾水。
線粒體檸檬酸(MCA)檢測(cè)試劑組成和配制：
酸性提取液：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。堿性提取液：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 7.5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 2.5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 7.5mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃ 保存；
標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，10μmol/mL 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。
線粒體中檸檬酸提?。?/span>
稱 0.05~0.1g 樣品（建議稱 0.1g 樣本），加入 0.5mL 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃離心 5min；取上清至另一 EP 管中，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取 300μL 該上清液和 300μL 堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì) CA 含量測(cè)定）；沉淀即線粒體，向沉淀中加入 0.5mL 酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），取此溶液300μL 和 300μL 堿性提取液中和，混勻，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。
線粒體檸檬酸(MCA)測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 330nm，蒸餾水調(diào)零。
2、試劑一、二和三 37℃預(yù)熱 10min。
3、樣本測(cè)定：
空白管和標(biāo)準(zhǔn)管通常只需要各做一個(gè)。
| 試劑名稱(μL) | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測(cè)定管 |
| 試劑一 | 300 | 300 | 300 |
|
| 蒸餾水 | 300 |
|
|
|
| 標(biāo)準(zhǔn)液 |
| 300 |
|
|
| 樣本 |
|
| 300 |
|
| 試劑二 | 100 | 100 | 100 |
試劑三 | 300 | 300 | 300 |
充分混勻，330nm 立即測(cè)定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2，ΔA=A2 –A1。
線粒體檸檬酸(MCA)含量計(jì)算：
（1）按蛋白濃度計(jì)算
檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管) ×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）=10×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)÷Cpr
蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)（貨號(hào)：QYS-237014）。
（2）按樣本鮮重計(jì)算
檸檬酸含量(μ mol/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管) ×V 樣]÷（W×V 樣÷V 樣總）=10×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，10μmol/mL； V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積：0.3mL；V 樣總：加入提取液體積：1mL；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
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