γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）說明書
For Research Use only
僅供研究用
貨號：QYS-231083
可見分光光度法：50 管/48 樣
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性測定意義：
GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL 基因表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL 活性高低對 GSH 含量和 GSH/GSSG比值有重要影響。
谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性測定原理：
在 ATP 和 Mg2+存在下，GCL 催化谷氨酸和半胱氨酸合成 γ-谷氨酰半胱氨酸；同時 ATP 去磷酸化產(chǎn)生無機(jī)磷分子，通過測定無機(jī)磷增加速率，即可計(jì)算出 GCL 活性。
自備儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1mL 玻璃比色皿、濃硫酸(自備）和蒸餾水。
谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性測定試劑組成和配制：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 14mL 蒸餾水充分震蕩溶解。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入蒸餾水 3.5 mL 充分震蕩溶解。
試劑四：液體×1 瓶，室溫保存。
試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 30mL 蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入1.0 mL濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定。
谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性測定操作
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 660 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管：取 1.5mLEp 管，依次加入試劑一 360 μL、試劑二 260μL 和試劑三 60μL，混勻后蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng) 15 min；再加入試劑四 300μL，混勻后， 25℃、8000g，離心10min，取上清 500μL，加入試劑五 500μL，混勻后蓋緊，45℃水浴 10min，冷卻后測定 660nm 處吸光值，記為 A 空白管。
3. 測定管：取 1.5mLEp 管，依次加入試劑一 240 μL、試劑二 260μL、試劑三 60μL 和上清液 120μL，混勻后蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng) 15 min； 再加入試劑四 300μL，混勻后，25℃、8000g，離心 10 min，取上清 500μL，加入試劑五 500μL，混勻后蓋緊，45℃水浴 10min，冷卻后測定 660 nm 處吸光值，記為 A 測定管。
注意：空白管只需測定一次。
谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.1427x，R2=0.9987
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無機(jī)磷的 GCL 酶活量為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /mg prot）=[（A 測定管-A 空白管）÷0.1427×V 反總]÷(Cpr×V 樣)÷T =3.815×（A 測定管-A 空白管）÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無機(jī)磷的 GCL 酶活量為為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /g 鮮重）= [（A 測定管-A 空白管）÷0.1427×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T = 3.815×（A 測定管-A 空白管）÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：37℃下，每 104 個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無機(jī)磷的 GCL 酶活量為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /104 cell）=[（A 測定管-A 空白管）÷ 0.1427×V 反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T = 3.815×（A 測定管-A 空白管）÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按照液體體積計(jì)算
活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無機(jī)磷的 GCL 酶活量為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /mL）= [（A 測定管-A 空白管）÷ 0.1427×V 反總]÷V 樣÷T = 3.815×（A 測定管-A 空白管）
0.1427：回歸方程系數(shù)；V 反總：反應(yīng)總體積（mL）980μL=0.980mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，120μL =0.12 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間：15min。
谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性測定注意事項(xiàng)
（1）樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復(fù)凍融。
（2）所有試劑配制完后，除表明 4℃保存外，請于 1 天內(nèi)用完。
（3）實(shí)驗(yàn)過程請帶手套，試劑三中有強(qiáng)腐蝕性物質(zhì)，注意不要濺到皮膚上或眼睛內(nèi)。
（4）測定吸光值時請于水浴后 10～40 分鐘內(nèi)測完。
（5）樣本測定前先取 1-2 個樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如吸光值太高，應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，使得吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，哺乳動物組織和血液一般稀釋 3～5 倍。
（6）試劑三配制過程中，可能會產(chǎn)生黑色固體，其不影響結(jié)果，注意吸取時不要將黑色固體吸入。
（7）細(xì)胞中 GCL 活性測定時，細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細(xì)胞中 GCL 的提取時可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞；
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